Detección de Actividad de Fosfatasa Alcalina de Origen Microbiano en Leche Cruda y su Relación con NMP De Coliformes

Abstract

Con la finalidad de detectar la actividad de fosfatasa alcalina y relacionarla con el número más probable (NMP) de bacterias coliformes por mililitro, se analizó muestras de leche cruda entera obtenidas de un programa de asistencia alimentaria del distrito de Chiclayo. El número más probable de bacterias coliformes de las muestras de leche cruda entera, fue estimado con el procedimiento ISO 7251, 2005 (NMP en tubo). Para la detección de actividad de fosfatasa alcalina (FA), se empleó 200µl de una muestra de leche homogenizada con 800µl de SDS 0,1%. Esta solución se pasó por un filtro de membrana de 0,22 µm de porosidad. Se descartó el filtrado. Las bacterias retenidas en el filtro fueron tratadas con buffer lisozima (50 µl: Tris-HCl 25mM, EDTA 10mM, Sucrosa 15%, pH 8,0 y lisozima 35 mg/ml). El filtrado resultante, que contiene FA, se enfrentó con una solución de fenil fosfato de sodio (sustrato), 4-aminoantipirina 29 mmol/l en aminometil propanol 3 mol/l a pH 10 (buffer) y ferrocianuro de potasio 10 mmol/l (agente oxidante). El tiempo de reacción fue 10 minutos a 37°C. El resultado se comparó con un patrón de fenol equivalente a 200 UI/l de FA. Para estimar la actividad de FA por bacteria, se utilizó Escherichia coli K-12 productora de la enzima. Se preparó un cultivo de 18 horas en caldo peptonado a partir del cual se hizo diluciones hasta 1: 512. Una muestra de cada dilución (950 µl) fue tratada con buffer lisozima (50 µl); luego, se determinó la actividad de FA de manera similar como se hizo con las muestras de leche. El número de bacterias en el cultivo de 18 horas fue contado con el procedimiento ISO 4832, 2006 (NMP en placa). Para relacionar el NMP de coliformes/ml con la actividad de FA en una muestra de leche, se tuvo en cuenta una ecuación logarítmica derivada de la actividad de la enzima. Este procedimiento fue sometido a validación interna siguiendo las recomendaciones de la Asociación Española de Farmacéuticos de la Industria, Organización de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentación y la Oficina de Administración de Alimentos y Medicamentos de Estados Unidos. Respecto a la validación de la selectividad de la prueba, se encontró 84,78% de interferencia. La prueba mostró linealidad; el coeficiente de correlación resultó 0,99 y el de determinación 99,8%. El coeficiente de variación fue 11,38%. El límite de detección resultó 0,093 UI/l de actividad de fosfatasa alcalina y el de cuantificación 0,309 UI/l. Se recomienda realizar ensayos de esta prueba en diferentes cepas productoras de la enzima.