Producción de controles positivos para PCR: Clonación de secuencias del gen POLY de los cuatro serotipos del virus de Dengue

Abstract

El dengue representa la principal enfermedad viral transmitida por mosquitos que impacta a la población humana, con más de 13 millones de casos y 8,186 muertes reportadas en el mundo, según la OMS. Los países más afectados incluyen Brasil, Colombia y Perú. Para el diagnóstico del virus del dengue (DENV) se emplean técnicas moleculares, las cuales requieren controles positivos confiables para su validación. El objetivo del presente estudio fue clonar secuencias representativas de los cuatro serotipos del DENV (1 al 4) para ser utilizadas como controles positivos en pruebas moleculares. En el presente trabajo cuantitativo, cuasiexperimental aplicado, se diseñó un fragmento de ADN sintético conteniendo regiones específicas de los cuatro serotipos. Mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR), se obtuvieron amplificaciones de las secuencias correspondientes a DENV 1–4, DENV 1, DENV 2, DENV 3 y DENV 4. Posteriormente, se realizó la ligación de estos fragmentos en el vector pGEM-T Easy y se procedió a transformar células de Escherichia coli NovaBlue y JM109. La transformación fue verificada mediante PCR de colonias, seguida del aislamiento de plásmidos recombinantes y la confirmación de los insertos mediante nueva PCR. Los resultados mostraron la clonación exitosa de los serotipos DENV 1, DENV 2 y DENV 3, mientras que no se logró la ligación efectiva del inserto DENV 4. Además, el inserto con secuencias combinadas DENV 1– 4 no fue detectado tras la verificación. Estos hallazgos sugieren que la presencia de un solo producto de PCR de banda precisa, amplia e intensa, favorece el éxito de la ligación. Se discutió que la eficiencia de clonación depende principalmente de la intensidad y especificidad del producto amplificado, así como de la competencia de las células transformadas Se observó que E. coli NovaBlue mostró mejor desempeño que JM109, cuyos cultivos resultaron sobrecargados y sin clones positivos. Estos resultados coinciden con reportes previos que destacan la importancia de condiciones óptimas de PCR y control bacteriano para lograr transformaciones exitosas. En conclusión, la calidad del producto de PCR y la selección adecuada de cepas bacterianas son factores determinantes para la eficiencia del proceso. Los controles positivos clonados representan una herramienta valiosa para la validación de diagnósticos moleculares del virus del dengue.

Dengue represents the leading mosquito-borne viral disease impacting the human population, with more than 13 million cases and 8,186 deaths reported worldwide, according to WHO. The most affected countries include Brazil, Colombia and Peru. Molecular techniques are used to diagnose dengue virus (DENV), which require reliable positive controls for validation. The objective of the present study was to clone representative sequences of the four DENV serotypes (1 to 4) to be used as positive controls in molecular tests. In the present quantitative, quasi-experimental applied work, a synthetic DNA fragment containing specific regions of the four serotypes was designed. Polymerase chain reaction (PCR) amplifications of the sequences corresponding to DENV 1-4, DENV 1, DENV 2, DENV 3 and DENV 4 were obtained. Subsequently, these fragments were ligated into the pGEM-T Easy vector and Escherichia coli NovaBlue and JM109 cells were transformed. Transformation was verified by colony PCR, followed by isolation of recombinant plasmids and confirmation of the inserts by repeat PCR. The results showed successful cloning of serotypes DENV 1, DENV 2 and DENV 3, whereas effective ligation of insert DENV 4 was not achieved. In addition, the insert with combined sequences DENV 1-4 was not detected after verification. These findings suggest that the presence of a single, broad and intense band-accurate PCR product favors successful ligation. It was discussed that cloning efficiency depends mainly on the intensity and specificity of the amplified product, as well as on the competence of the transformed cells E. coli NovaBlue was observed to perform better than JM109, whose cultures were overloaded and without positive clones. These results are in agreement with previous reports that highlight the importance of optimal PCR conditions and bacterial control for successful transformations. In conclusion, the quality of the PCR product and the adequate selection of bacterial strains are determining factors for the efficiency of the process. Cloned positive controls represent a valuable tool for the validation of molecular diagnostics of dengue virus.