Inserción y sustitución de aminoácidos en el switch I de septina 6: implicancia en la actividad GTPasa de la correcta heteropolimerización de septina

Abstract

Introducción: Las septinas, proteínas esenciales en el citoesqueleto celular, desempeñan roles cruciales en procesos como la citocinesis y la interacción celular. Este trabajo se centra en los grupos SEPT2 y SEPT6, diferenciados por su capacidad de hidrolizar GTP. La ausencia de esta función en SEPT6 plantea interrogantes sobre su evolución y función. Materiales y Métodos: Se empleó un diseño experimental de contrastación de hipótesis con la población de septinas humanas disponibles en NCBI. Se realizaron mutaciones en la SEPT6 para introducir 8 aminoácidos conservados de SEPT2 y SEPT7, evaluando los parámetros físico-químicos, el sub-clonamiento del gen mutante, la co-expresión de proteínas, purificación, análisis de contenido de nucleótidos, espectrometría de masas y modelado molecular con AlphaFold. Resultados: Las mutaciones no generaron actividad catalítica en SEPT6 respecto a la hidrólisis del GTP. Análisis de contenido de nucleótidos mostró presencia de GTP y GDP, indicando la inactividad de SEPT6 aún con las mutaciones. El modelado con AlphaFold reveló diferencias en la interfaz de unión de SEPT6-SEPT2 respecto al dímero nativo. Discusión: Las septinas, especialmente SEPT6 en el grupo II, carecen de actividad catalítica, esto puede tener funciones importantes en la formación de heterofilamentos con septinas del grupo III como SEPT2. Los intentos de restaurar la actividad catalítica mediante modificaciones en el motivo switch I de SEPT6 no tuvieron éxito debido posiblemente a un impedimento estérico. Los modelos estructurales revelan diferencias significativas entre SEPT2 y SEPT6, lo que puede explicar la falta de actividad en SEPT6, sin embargo se tienen que analizar con mucho criterio y cuidado. Se destaca la complejidad para otorgar actividad catalítica a SEPT6, aun al insertar la treonina catalítica en la posición correcta. Es fundamental comprender las interacciones específicas entre las septinas para comprender mejor su función celular. Conclusiones: Los esfuerzos por restaurar la actividad fueron infructuosos, sugiriendo un desafío significativo en la ingeniería de proteínas. Las diferencias estructurales entre los grupos de septinas podrían ser responsables de esta falta de actividad. Se resalta la necesidad de investigaciones adicionales para comprender completamente el papel de las septinas en los procesos celulares.

Introduction: Septins, essential proteins in the cellular cytoskeleton, play crucial roles in processes such as cytokinesis and cell interaction. This work focuses on the SEPT2 and SEPT6 groups, distinguished by their GTP hydrolyzing capacity. The absence of this function in SEPT6 raises questions about its evolution and function. Materials and Methods: An experimental hypothesis testing design was employed with the human septin population available in NCBI. Mutations were made in SEPT6 to introduce 8 conserved amino acids from SEPT2 and SEPT7, evaluating physicochemical parameters, mutant gene sub-cloning, protein co-expression, purification, nucleotide content analysis, mass spectrometry, and molecular modeling using AlphaFold. Results: Mutations did not generate catalytic activity in SEPT6 regarding GTP hydrolysis. Nucleotide content analysis showed the presence of GTP and GDP, indicating SEPT6 inactivity even with mutations. AlphaFold modeling revealed differences in the SEPT6-SEPT2 binding interface compared to the native dimer. Discussion: Septins, especially SEPT6 in group II, lack catalytic activity, possibly playing a crucial role in heterofilament formation with group III septins like SEPT2. Attempts to restore catalytic activity through modifications in SEPT6's switch I motif were unsuccessful, likely due to steric hindrance. Structural models show significant differences between SEPT2 and SEPT6, potentially explaining SEPT6's lack of activity; however, careful analysis is needed. Granting catalytic activity to SEPT6 remains complex, even by inserting the catalytic threonine in the correct position. Understanding specific interactions among septins is crucial for better comprehension of their cellular function. Conclusions: Efforts to restore activity were unsuccessful, suggesting a significant challenge in protein engineering. Structural differences between septin groups may account for this lack of activity. Further research is necessary to fully understand septins' role in cellular processes.